Replikacijsko-transkripcijski kompleks koronavirusa: pomembna in selektivna NMPilacija podenot NiRAN-RdRp na ohranjena mesta v nsp9

Uredil Peter Sarnow, Medicinska fakulteta Univerze Stanford, Univerza Stanford, Kalifornija, odobreno 25. decembra 2020 (pregledano 25. oktobra 2020)

Poročamo o interakciji med podenotami pri podvajanju kompleksov koronavirusa in transkripcije, ki so bistveni za podvajanje in evolucijsko ohranjanje.Predložili smo dokaze, da ima domena NiRAN, povezana z nsp12, aktivnost nukleozid monofosfat (NMP) transferaze v transu, in identificirali nsp9 (protein, ki veže RNK), kot svojo tarčo.NiRAN katalizira kovalentno vezavo dela NMP na ohranjeni amino konec nsp9 v reakciji, ki temelji na ionih Mn2+ in sosednjih ohranjenih ostankih Asn.Ugotovljeno je bilo, da sta aktivnost NiRAN in NMPilacija nsp9 bistveni za razmnoževanje koronavirusa.Podatki nam omogočajo, da to aktivnost encimskega markerja ugnezdenega virusa povežemo s prejšnjimi opažanji v hipotezi, da je začetek sinteze RNA v razredu virusov RNA funkcionalno in evolucijsko skladen.

RNK-odvisna RNK polimeraza (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae in 12 drugih družin) je povezana z amino-terminalno (N-terminalno) domeno v nestrukturnem proteinu (nsp), ki se sprošča iz poliproteina, imenovanega NiRAN 1ab je sestavljen iz virusne glavne proteaze (Mpro).Pred tem so poročali o lastni aktivnosti GMPilacije/UMPilacije arterijskega virusa NiRAN-RdRp nsp in predlagali so, da se ustvari prehodno stanje za prenos nukleozid monofosfata (NMP) na (trenutno neznan) virus in/ali celične biopolimerizacijske stvari.Tukaj prikazujemo, da ima koronavirus (človeški koronavirus [HCoV]-229E in koronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma) nsp12 (NiRAN-RdRp) NMPilacijsko aktivnost, odvisno od Mn2+, ki izhaja iz nsp9 prek tvorbe nsp9, ki jo posreduje Mpro. N-terminalni nssp, ki obdaja, se proteolitično sprosti, fosforamidat se veže na primarni amin (N3825) na N-terminalu nsp9.Uridin trifosfat je prednostni nukleotid v tej reakciji, vendar so primerni kosubstrati tudi adenozin trifosfat, gvanozin trifosfat in citidin trifosfat.Študije mutacij z uporabo rekombinantnih proteinov nsp9 in nsp12 koronavirusa ter gensko spremenjenih mutantov HCoV-229E so določile ostanke, potrebne za z NiRAN posredovano nsp9 NMPilacijo in replikacijo virusa v celični kulturi.Podatki so potrdili napoved ostankov aktivnih mest NiRAN in določili pomembno vlogo ostankov nsp9 N3826 pri NMPilaciji nsp9 in replikaciji virusa in vitro.Ta ostanek je del ohranjenega N-terminalnega tripeptidnega zaporedja NNE in se je izkazal za edinega nespremenljivega ostanka nsp9 in njegovih homologov v družini koronavirusov.Ta študija zagotavlja trdne temelje za funkcionalno študijo aktivnosti NMPilacije drugih ugnezdenih virusov in predlaga možne cilje za razvoj protivirusnih zdravil.

Virus pozitivne verige RNA Nidovirales okuži različne vretenčarje in nevretenčarje (1, 2).Vrstni red trenutno vključuje 14 družin (3), od katerih je bila družina Coronavirus obsežno raziskana v zadnjih 20 letih.Takrat so trije zoonotski koronavirusi izšli iz živalskih gostiteljev in povzročili obsežne izbruhe hudih okužb dihal pri ljudeh.Vključno s trdovratnimi pandemijami, ki jih povzročajo hude akutne nalezljive bolezni.Respiratorni sindrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusi imajo skupno organizacijo genoma in podenota membransko vezanega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC) je kodirana v dveh tretjinah 5-?²-terminala in glavni strukturni podenoti virusnega delca, kot tudi nekateri dodatki .Protein, kodiran v 3??² končni tretjini genoma (1).Razen ene družine planarskih virusov (Monoviridae) (8) vsi ugnezdeni virusi kodirajo podenote RTC v dveh velikih odprtih bralnih okvirjih (ORF) ORF1a in ORF1b, ki sta prevedena iz genomske RNA.ORF1a kodira poliprotein (pp) 1a, ORF1a in ORF1b pa skupaj kodirata pp1ab.S splošno udeležbo glavne proteaze (Mpro), ki jo kodira ORF1a, se tako pp1a kot pp1ab proteolitično predelata v različne nestrukturne proteine ​​(nsps), znane tudi kot 3CLpro, ker je homologen s 3Cpro pikornavirusa ( 9).Ti nsps naj bi bili sestavljeni v velik dinamični RTC, katalizirajo sintezo genomske RNA (replikacija) in niza subgenomske RNA (transkripcija) in se uporabljajo za usklajevanje izražanja ORF, ki se nahaja dolvodno od ORF1b (10?? ?12).

Osrednji RTC vključuje od RNK odvisno polimerazo RNK (RdRp) (13), helikazo superdružine 1 (HEL1) (14, 15) in več encimov za obdelavo RNK, ki so v glavnem kodirani v ORF1b in v družini koronavirusov. Vsebuje nsp12-nsp16 in nsp9-nsp12 v družini Arterioviridae (glej referenco 10ââ 12).RdRp in HEL1 predstavljata dve (eno petino) ohranjeni domeni virusa ptičjega gnezda in sta homologni med drugimi virusi RNA.Verjame se, da jedrni replikazi pomagajo druge podenote, vključno z več majhnimi nsp, ki se sproščajo iz regije karboksi-terminala (C-terminal) pp1a, nižje od Mpro (koronavirus nsp5 oziroma arterijski virus nsp4).Imajo omejeno družinsko specifično zaščito in raznolike dejavnosti (pregledano v referenci 10ââ12).

Pri koronavirusu domena NiRAN vsebuje ??1/450 ostankov in je povezana s C-terminalno domeno RdRp preko povezovalne regije (16?19).Kjer N pomeni NiRAN) (16).N-terminalna obroba teh motivov je manj konzervativen motiv preAN.Ohranjeni ostanki NiRAN koronavirusa, nameščeni v elektronski mikrostrukturi.Rekombinantni protein (17).Špekulira se, da bo dokumentirana (samo)U/GMPilacija povzročila prehodno stanje za prenos NMP na (trenutno neznan) substrat (16), strukturna podobnost med NiRAN in protein kinazo (17, 19) pa je hipoteza, da NiRAN modificira druge proteine.

Številne lastnosti, vključno z edinstveno in edinstveno sistematično povezavo z ugnezdenimi virusi in genetsko ločitvijo od RdRp, naredijo NiRAN razumen ključni regulativni encim za ugnezdene viruse, kar je ključnega pomena za njihov nastanek in identiteto.Prej so bile imenovane tri možne funkcije, ki vključujejo NiRAN za uravnavanje genomskega/subgenomskega prevajanja ali replikacije/transkripcije.Če upoštevamo tedaj na voljo redke in nepopolne podatke, ima vsaka funkcija svoje prednosti in slabosti (16).V tej raziskavi želimo združiti biokemične in povratne genetske študije koronavirusov, ki predstavljata oba roda, in naše ugotovitve postaviti v evolucijsko ozadje naravne mutacije družine koronavirusov, da bi pridobili vpogled v to skrivnostno kraljestvo.Poročamo o velikem napredku v razumevanju NiRAN z identifikacijo naravnih tarč v RTC, ki (med tremi razpoložljivimi hipotezami) prispeva k vlogi te domene pri sprožitvi sinteze ugnezdene virusne RNA.Ta raziskava prav tako odpira možnosti za druge vloge NiRAN na gostiteljskem vmesniku virusa.

Da bi opisali encimske lastnosti domene NiRAN nsp12, povezane s korona virusom, smo izdelali rekombinantno obliko človeškega koronavirusa 229E (HCoV-229E) nsp12 v E. coli z oznako His6 na C-koncu in združili protein z [α32-P] Inkubirajte skupaj z NTP v prisotnosti MnCl2, kot je opisano v Materialih in metodah.Analiza reakcijskega produkta je pokazala prisotnost radioaktivno označenega proteina, ki migrira skupaj z nsp12 (106 kDa), kar kaže, da nsp12 koronavirusa katalizira tvorbo kovalentnih aduktov protein-NMP, ki se prednostno tvorijo z uridin monofosfatom (UMP) (slika 1A) in B).Kvantitativna analiza je pokazala, da se je v primerjavi z drugimi nukleotidi intenzivnost signala vključitve UMP povečala za 2- do 3-krat (slika 1C).Ti podatki so skladni s predvideno aktivnostjo transferaze NMP domene NiRAN koronavirusa (16), vendar kažejo, da so nukleotidne preference domene NiRAN koronavirusa in arterijskega virusa različne.

Aktivnost samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) smo 30 minut inkubirali z označenim [α-32P] NTP v prisotnosti 6 mM MnCl2 (za podrobnosti glejte Materiali in metode).Reakcijske produkte smo ločili s SDS-PAGE in obarvali s Coomassie briljantno modro.(B) Radioaktivno označeni protein se vizualizira s slikanjem s fosforjem.Položaji nsp12-His6 in markerjev molekulske mase proteina (v kilodaltonih) so prikazani v A in B. (C) Intenzivnost radioaktivnega signala (srednja vrednost ± SEM) je bila določena iz treh neodvisnih poskusov.*P≤0,05.Moč signala (v odstotkih) je povezana z UTP.

Čeprav se je izkazalo, da so encimske aktivnosti, povezane z NiRAN, bistvene za replikacijo EAV in SARS-CoV v celični kulturi (16), specifična funkcija NiRAN in potencialni cilji še niso določeni.Nedavno poročana strukturna podobnost med NiRAN in družino proteinov z gubami, podobnimi proteinski kinazi (17, 22), nas je spodbudila k testiranju hipoteze, da NiRAN katalizira NMPilacijo drugih proteinov.Ustvarili smo nabor potencialnih homolognih tarč, vključno z nestrukturnimi proteini, ki jih kodira HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), od katerih vsaka vsebuje C-terminalno oznako His6 (dodatek SI, tabela S1) in inkubirajo te proteine ​​z [α32-P] uridin trifosfatom ([α32-P]UTP) v prisotnosti ali odsotnosti nsp12.Goveji serumski albumin in fuzijski protein MBP-LacZα, proizveden v E. coli, sta služila kot kontrola (slika 2A, proge 1 do 7).Radioaktivno označeni protein je bil analiziran z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in avtoradiografijo in ugotovljeno je bilo, da je v reakciji, ki je vsebovala nsp12 in nsp9, obstajal močan radioaktivni signal.Položaj signala ustreza molekulski masi nsp9, kar kaže na UMPilacijo nsp9, posredovano z nsp12 (slika 2B, steza 7).Ugotovljeno je bilo, da noben drugi testni protein ni bil UMPiliran, kar nas je privedlo do zaključka, da je nsp9 specifičen substrat nsp12.V skladu s podatki o samo-NMPilaciji, prikazanimi na sliki 1, lahko nsp12 prenese vse štiri NMP na nsp9, čeprav je učinkovitost drugačna, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> gvanozin monofosfat (GMP)> citidin monofosfat (CMP) ) ( Slika).3 A in B).Pod pogoji, uporabljenimi v tem testu (skrajšanje časa reakcije in izpostavljenosti, zmanjšanje koncentracije nsp12; materiali in metode), samo-NMPilacije nsp12 ni bilo mogoče zaznati (primerjaj sliko 2B, pas 7 in sliko 1B), kar se je izkazal za učinkovitega (in več krogov) UMP premaknil z nsp12 na nsp9.Za aktivnost UMP transferaze je potrebna prisotnost ionov Mn2+, kot je prikazano na sliki 3C, medtem ko so v prisotnosti Mg2+ opazili le minimalno aktivnost UMP transferaze, v prisotnosti drugih dveh testiranih dvovalentnih kationov pa nobene aktivnosti.Podobni podatki so bili pridobljeni v testih NMPilacije, ki so vsebovali citidin trifosfat (CTP), gvanozin trifosfat (GTP) in adenozin trifosfat (ATP) (dodatek SI, slika S1).

HCoV-229E UMPilacija nsp9, posredovana z nsp12.Serija proteinskih substratov (vključno z govejim serumskim albuminom, MBP-lacZα in serijo HCoV-229E nsps, označenih s C-terminalnim His6, kodiranim z ORF1a), je bila uporabljena za ovrednotenje UMPilacijske aktivnosti HCoV-229E nsp12-His6⁺ posredovane beljakovine.Inkubirajte protein z [α-32P] UTP 10 minut v odsotnosti (A) ali prisotnosti (B) nsp12, kot je opisano v materialih in metodah.Na vrhu A in B je prikazan SDS-poliakrilamidni gel, obarvan s Coomassie Brilliant Blue, na dnu A in B pa sta prikazana ustrezna avtoradiograma.Položaj markerja molekulske mase proteina (v kilodaltonih) je podan na levi.Navedena sta tudi položaj nsp12-His6 (B, zgoraj) in radioaktivni signal, opažen med inkubacijo nsp12-His6 z nsp9-His6 (B, steza 7), kar kaže, da [α-32P]UMP na nsp9-His6 (12,9 kDa), kar ni bilo opaženo pri drugih testiranih proteinih.

HCoV-229E NiRAN-posredovana biokemična in virološka karakterizacija NMPilacije nsp9.(A in B) Vloga nukleotidnega ko-substrata, uporabljenega v reakciji.Nsp12-His6 in nsp9-His6 se zmešata in inkubirata v prisotnosti različnih [α-32P] NTP v standardnem testu NMPilacije.(A, zgoraj) S kumasijem obarvan nsp9-His6, ločen s SDS-PAGE.(A, spodaj) Avtoradiografija istega območja gela.(B) Relativna aktivnost (povprečje ± SEM) v prisotnosti določenega nukleotidnega kofaktorja je določena iz treh neodvisnih poskusov.*P≤0,05.(C) Vloga kovinskih ionov.Prikazan je standardni test NMPilacije v prisotnosti [α-32P] UTP in različnih kovinskih ionov, vsak s koncentracijo 1 mM.V C je prikazan zgornji nsp9-His6, obarvan s Coomassie, in v C, spodnji, je prikazana ustrezna avtoradiografija.Velikost označenega proteina (v kilodaltonih) je prikazana levo od A in C. (D) Mutantna oblika HCoV-229E nsp12-His6, ki nosi navedeno aminokislinsko substitucijo, je v [α-32P]UTP, kot je opisano v Materialih in metodah.Radioaktivno označen nsp9-His6, proizveden v reakciji NMPilacije, se odkrije s fosforilacijskim slikanjem (D, zgoraj).Relativna aktivnost v primerjavi z beljakovino divjega tipa (wt) je prikazana v D, dno pa je vzeto kot povprečje (±SEM) iz treh neodvisnih poskusov.Zvezdice označujejo zamenjave neohranjenih ostankov.(E) Titer virusa v supernatantu kulture celic p1, pridobljenih 24 ur po okužbi, je bil določen s testom plakov.Navedene so substitucije kodona v domeni NiRAN zgrajenega mutanta HCoV-229E (številčenje ostankov temelji na njihovem položaju v pp1ab).Kot kontrola je bil uporabljen mutant aktivnega mesta RdRp s pomanjkljivo replikacijo nsp12_DD4823/4AA.

Da bi globlje razumeli aktivno mesto NiRAN in določili ostanke, povezane z aktivnostjo nsp9-specifične NMP transferaze, smo izvedli analizo mutacij, v kateri smo zamenjali konzervativne ostanke v motivih NiRAN AN, BN in CN ( 16) To je Ala (dodatek SI, slika S2).Poleg tega je bil v dveh primerih ovrednoten vpliv konzervativnih substitucij Arg-to-Lys ali Lys-to-Arg.As a (negative) control, residues that are not or less conserved in the NiRAN domain of coronaviruses and other nested viruses are replaced with Ala. Replacing K4116A (in motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) in D4280A (CN) znatno zmanjša ali celo odpravi nsp9 NMPilacijo preko nsp12, medtem ko proteini s konzervativnimi substitucijami (R4178K), K4116R) ohranijo 60% in 80% svoje aktivnosti, kar kaže na sprostitev omejitev na njihovi strani. verig je fizikalno-kemijsko občutljiv (slika 3D).Zamenjava več drugih ohranjenih ostankov E4145A, D4273A, F4281A in D4283A je veliko manj škodljiva, UMPilacija nsp9 pa se le zmerno zmanjša.Podobni rezultati so bili pridobljeni v reakcijah NMPilacije nsp9, ki vključujejo druge NTP (slika 3D in dodatek SI, slika S3), kar potrjuje, da so opaženi učinki na specifične aminokislinske substitucije neodvisni od vrste uporabljenega nukleotidnega ko-substrata.Nato smo testirali možen vpliv teh substitucij nsp12 na replikacijo koronavirusov v celični kulturi.V ta namen smo uporabili ustrezne gensko spremenjene predloge komplementarne DNA (cDNA), klonirane v rekombinantnem virusu vakcinije (23, 24), da smo prepisali 5-7 celic.Titracija potomstva kužnega virusa, proizvedenega v teh celicah, je pokazala, da večina mutantov HCoV-229E NiRAN ni izvedljivih (slika 3E).Skupina virusnih mutantov, ki niso sposobni preživeti, vključuje alternative, za katere je bilo dokazano, da odpravijo ali znatno zmanjšajo aktivnost transferaze NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), vendar obstajata še dve drugi možnosti (K4116R, E4145A) 80 % rezervirano?Njihova aktivnost in vitro NMPilacije kaže, da so vključene dodatne omejitve.Podobno sta dve drugi mutaciji (R4178K, F4281A), ki sta povzročili zmerno zmanjšanje aktivnosti in vitro NMPilacije NiRAN, proizvedli žive viruse, vendar so ti virusi znatno zmanjšali titre z replikacijo.V skladu s podatki o aktivnosti in vitro, prikazanimi na sliki 3D, je zamenjava štirih drugih ostankov, ki niso ohranjeni v koronavirusu in/ali drugih ugnezdenih virusih (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), proizvedla žive viruse. zmerno znižan titer v primerjavi z virusom divjega tipa (slika 3E).

Da bi preučili, ali je aktivnost transferaze NMP, ki jo posreduje NiRAN, odvisna od aktivne domene RdRp, sta bila dva ohranjena ostanka Asp, ki sodelujeta pri koordinaciji dvovalentnih kovinskih ionov (11) v motivu C RdRp, zamenjana z Ala. Nastali protein nsp12_DD4823/4AA ohrani njegova aktivnost NMPilacije nsp9, kar kaže, da aktivnost NMPilacije nsp9 in vitro, ki jo posreduje nsp12, ne zahteva aktivnosti polimeraze (Dodatek SI, Slika S4).

Po ugotovitvi nsp9-specifične aktivnosti NMP transferaze za nsp12 smo poskušali karakterizirati adukt NMP-nsp9 z masno spektrometrijo (MS).Celoten proteinski masni spekter rekombinantnega HCoV-229E nsp9 je pokazal vrh pri 12.045 Da (slika 4A).Dodatek nsp12 ni spremenil kakovosti nsp9, kar kaže, da nsp12 in nsp9 ne bi tvorila stabilnega kompleksa pod uporabljenimi pogoji (denaturacija) (slika 4A).V prisotnosti UTP in GTP je merjenje mase reakcije, ki vsebuje nsp9 oziroma nsp12, pokazalo, da se je masa proteina UTP premaknila za 306 Da, masa proteina GTP pa za 345 Da, kar kaže, da vsaka molekula nsp9 veže UMP ali GMP (Slika 4) C in D).Špekulira se, da energija, potrebna za nsp9 NMPilacijo, ki jo posreduje NiRAN, izvira iz hidrolize NTP in sproščanja pirofosfata.Čeprav je bil v tej reakciji uporabljen 10-kratni molski presežek nsp9 (tarča) kot nsp12 (encim), so opazili skoraj popolno NMPilacijo nsp9, kar kaže, da je interakcija med nsp12 in nsp9 kratkotrajna in da lahko nsp12 NMPilira več nsp9 in vitro molekula.

Enotna NMPilacija nsp9 v prisotnosti nsp12 in UTP ali GTP.Prikazan je dekonvolucijski popolni proteinski masni spekter HCoV-229E nsp9 (dodatek SI, tabela S1) (AD).(A) sam nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 v prisotnosti UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 v prisotnosti GTP.

Za določitev ostankov nsp9 UMP, ki jih nsp12 deli, je bil nsp9-UMP cepljen s tripsinom.Nastale peptide smo ločili s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) in analizirali s tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS) na spletu.Analiza podatkov z uporabo programskega paketa Byonic (Protein Metrics) je pokazala UMPilacijo N-terminalne aminokisline.To se potrdi ročno.Tandemski masni spekter prekurzorskega peptida [UMP]NNEIMPGK (dodatek SI, slika S5A) je razkril fragment pri 421 m/z, kar kaže, da se UMP veže na ostanek 1 nsp9.

Na N-koncu nsp9 je Asn ohranjen med člani Orthocoronavirinae (dodatek SI, slika S6).Čeprav verjamemo, da je N-terminalni primarni aminski dušik najverjetnejši akceptor za UMP, smo se odločili pridobiti dodatne dokaze o vezavi NMP na N-terminalu.Iz tega razloga je bil ne-NMPiliran in NMPiliran N-terminalni peptid nsp9, očiščen s HPLC, pridobljen v prisotnosti acetona in natrijevega cianoborhidrida.Pod temi pogoji je mogoče s propilom modificirati samo proste primarne amine (25).N-terminalni peptid, pridobljen iz nsp9, z zaporedjem NNEIMPGK vsebuje dva primarna amina, enega na N-koncu Asn in drugega na stranski verigi Lys na C-koncu.Zato lahko propilne skupine uvedemo na obeh koncih.Ekstrahirani ionski kromatogrami ne-NMPiliranih peptidov so prikazani v dodatku SI, slika S5B.Kot je bilo pričakovano, je mogoče identificirati N-terminalne in C-terminalne (mono)propilirane (dodatek SI, slika S5B, zgornji pas) in dipropilirane peptide (dodatek SI, slika S5B, spodnji pas).Ta vzorec se spremeni z uporabo NMP-piliranega N-terminalnega peptida nsp9.V tem primeru je mogoče identificirati samo C-terminalne propilirane peptide, vendar N-terminalni propilirani peptidi in dipropilirani peptidi niso identificirani (SI dodatek, slika S5C), kar kaže, da je bil UMP prenesen na N-terminalni primarni amin, da se to prepreči skupine pred spreminjanjem.

Nato zamenjamo (z Ala ali Ser) ali izbrišemo ohranjene ostanke na N-koncu nsp9, da definiramo ciljno specifične omejitve.Na podlagi naših podatkov MS, ki kažejo, da NiRAN tvori adukt nsp9-NMP s primarnim aminom N-terminalnega ostanka nsp9, smo domnevali, da NMPilacija nsp9 zahteva glavno virusno proteazo (Mpro, nsp5), da sprosti N-terminal nsp9 iz njegov poliproteinski predhodnik.Da bi preizkusili to hipotezo, smo izdelali prekurzorski protein nsp7-11, ki je vseboval nsp9 v E. coli, in izvedli standardni NMPilacijski test v prisotnosti [α-32P] UTP (materiali in metode).Kot je prikazano na sliki 5A (proga 3), nerazrezani prekurzor nsp7-11 ni radioaktivno označen z nsp12.V nasprotju s tem, če nsp7-11 razcepi rekombinantni nsp5, da sprosti nsp9 (in druge nssp) iz prekurzorja, se zazna radioaktivno označen protein, ki migrira z nsp9, kar potrjuje naš sklep, da NiRAN in N-selektivna tvorba kovalentnih aduktov nsp9-NMP .Končni primarni amin N-terminalnega Asn (položaj 3825 v pp1a/pp1ab).To ugotovitev podpirajo tudi poskusi z uporabo konstrukta nsp9, ki vsebuje enega ali dva dodatna ostanka na N-koncu.V obeh primerih je bila UMPilacija nsp9, posredovana z NiRAN, ukinjena (Dodatek SI, slika S7).Nato smo izdelali protein z enim ali dvema ostankoma Asn, izbrisanima iz peptidne sekvence 3825-NNEIMPK-3832 na N-terminalu nsp9.V obeh primerih je bila UMPilacija nsp9 popolnoma blokirana (slika 5B), kar je zagotovilo dodatne dokaze, da pravi N-konec nsp9 deluje kot receptor NMP.

Proteolitična obdelava nsp9 in vloga N-terminalnih ostankov pri UMPilaciji, posredovani z nsp12.(A) UMPilacija nsp9 zahteva prost N-terminal nsp9.Nsp7-11-His6 je predhodno inkubiran pri 30 °C v pufru za odkrivanje NMPilacije, ki vsebuje UTP, v prisotnosti ali odsotnosti rekombinantnega Mpro (nsp5-His6).Po 3 urah začnite preizkus NMPilacije z dodajanjem nsp12-His6, kot je opisano v Materialih in metodah.Reakcijo, ki vsebuje nsp5-His6 (proga 1) in nsp9-His6 (proga 2), smo uporabili kot kontrolo.Po 10 minutah smo reakcijo zaključili in reakcijsko zmes ločili s SDS-PAGE.Protein je bil obarvan s Coomassie Brilliant Blue (A, zgoraj).Prekurzor Nsp7-11-His6 in predelani produkt, ki izhaja iz cepitve, posredovane z nsp5-His6, sta prikazana na desni.Upoštevajte (zaradi njune majhnosti), da nsp7 in nsp11-His6 ni mogoče zaznati v tem gelu, reakcija pa je dopolnjena z nsp5-His6 (progi 1 in 4; položaj nsp5-His6 je označen s polnim krogom) ali nsp9-His6 (proga 2) vsebuje majhno količino MBP (označeno z odprtimi krogi) kot preostale nečistoče, ker so izražene kot fuzijski proteini MBP (dodatek SI, tabela S1).(B) Različica Nsp9-His6 nima enega ali dveh N-terminalnih ostankov Asn (številčenje ostankov glede na položaj v pp1a/pp1ab) in je prečiščena ter inkubirana z nsp12-His6 in [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, obarvana s Coomassie, je prikazana na vrhu, B, ustrezen avtoradiograf je prikazan na dnu.Položaj markerja molekulske mase (v kilodaltonih) je prikazan na levi.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-končni ohranjeni ostanki so bili nadomeščeni z Ala ali Ser in enaka količina proteina je bila uporabljena v nsp12-His6 posredovani reakciji UMPilacije.Reakcijske produkte smo ločili s SDS-PAGE in obarvali s Coomassie Brilliant Blue (C, zgoraj), radioaktivno označen nsp9-His6 pa smo odkrili s fosforescenčnim slikanjem (C, sredina).Z uporabo proteina divjega tipa (wt) kot referenčnega (nastavljenega na 100 %) je bila relativna aktivnost NMPilacije (povprečje ± SEM) izračunana iz treh neodvisnih poskusov.(D) Titre virusa v supernatantu celične kulture p1 celic Huh-7, okuženih s celicami Huh-7 divjega tipa HCoV-229E, in mutanti, ki nosijo določene aminokislinske substitucije v nsp9, so določili s testom plakov.Dvojni mutant DD4823/4AA z RdRp motivom C s pomanjkljivo replikacijo je bil uporabljen kot negativna kontrola.

N-konec nsp9 (zlasti položaji 1, 2, 3 in 6) je med člani poddružine Orthocoronavirinae zelo ohranjen (dodatek SI, slika S6).Da bi preučili možno vlogo teh ostankov pri NMPilaciji nsp9, posredovani z nsp12, sta bila dva zaporedna ostanka Asn na N-koncu nsp9 nadomeščena z Ala ali Ser (samo ali v kombinaciji).V primerjavi z divjim tipom nsp9 je zamenjava N3825 z Ala ali Ser povzročila več kot dvakratno zmanjšanje UMPilacije, posredovane z nsp12 (slika 5C).V skladu z našim zaključkom, da se NMPilacija pojavi na N-terminalnem primarnem aminu namesto na stranski verigi N-terminalnega ostanka, smo opazili znatno preostalo NMPilacijo z zamenjavo N3825A in N3825S.Zanimivo je, da če je drugi Asn nadomeščen z Ala ali Ser, se UMPilacija nsp9 močneje zmanjša (več kot 10-krat), medtem ko ima zamenjava Ala na položajih 3, 4 in 6 le zmeren učinek na UMPilacijo nsp9 (slika 2 ) .5C).Podobni rezultati so bili pridobljeni z uporabo ATP, CTP ali GTP (dodatek SI, slika S8).Ti podatki skupaj kažejo na ključno vlogo N2826 (položaj 2 v nsp9) pri NMPilaciji nsp9.

Da bi pridobili dodatne dokaze o funkcionalni korelaciji med N-koncem nsp9 in NMPilacijo, smo izvedli večkratno poravnavo zaporedja (MSA) zaporedja nsp9 družine Coronavirus (ki se giblje med 104 in 113 ostanki) (SI dodatek, slika S6).Pri 47 (znanih in domnevnih) vrstah iz 5 rodov poddružine Orthocoronavirinae, ki okužijo različne gostitelje sesalcev, ptic in plazilcev, je bilo ugotovljeno, da je nespremenljivih le 8 ostankov.Najobsežnejše spremembe, vključno z delecijami in vstavitvami, so opazili v ciklih med sekundarnimi strukturnimi elementi nsp9, kot je bilo ugotovljeno s prejšnjimi strukturnimi študijami (26–28).Pet invariantnih ostankov je bilo najdenih v verigi β in vijačnici α C-terminalnega dela nsp9.Trije invariantni ostanki sestavljajo NNE motiv N konca nsp9.Razkrito je, da je drugi Asn tega motiva edini nespremenljivi ostanek, ki si ga deli tudi hipotetični nsp9 oddaljeno sorodnega žabjega koronavirusa in predstavlja vrsto Microhyla letovirus 1 v poddružini Letovirinae Alphaletovirusa.Ohranjanje ostankov v elementih sekundarne strukture nsp9 je mogoče racionalizirati s strukturnimi premisleki, da se ohrani zlaganje ali znane lastnosti vezave RNA.Vendar se zdi, da to razmišljanje ne velja za ohranjanje NNE in pred to študijo je bila narava omejitev, ki omejujejo variacijo tripeptidnega zaporedja, popolnoma zakrita.

Da bi ugotovili pomen nsp9-NMPilacije in ohranjanja NNE pri replikaciji koronavirusa, smo izdelali mutante HCoV-229E, ki nosijo enojne ali dvojne substitucije N-terminalnih ostankov nsp9, kar kaže, da je nsp9 NMPilacija škodljiva in vitro.Preden začnemo, poskušamo odgovoriti na vprašanje, ali te substitucije (v bližini mesta cepitve nsp8|9) vplivajo na proteolitično procesiranje regije C-terminal pp1a.Niz poliproteinskih konstruktov nsp7-11, ki vsebuje ustrezne substitucije na N-koncu nsp9, je bil proizveden v E. coli in razrezan z rekombinantnim Mpro.Na proteolitično cepitev štirih mest (vključno z stranskim mestom nsp9) nobena uvedena substitucija ne vpliva bistveno (dodatek SI, slika S9), razen strukturnih sprememb v teh proteinih, ki motijo ​​cepitev nsp8|9, ki jo posreduje Mpro (ali drugo) Spletna stran.

Celice Huh-7 so bile transfektirane z genomsko dolžino HCoV-229E RNA, ki kodira substitucije Ala ali Ser v ohranjenih tripeptidih NNE (N3825, N3826 in E3827) na koncu Nsp9, kar kaže, da je večina mutacij usodnih.Virus smo lahko rešili z zamenjavo Ser ali Ala N-končnega Asn (N2835A ali N2835S), vendar virusa nismo uspeli obnoviti z drugimi enojnimi in dvojnimi mutacijami v zaporedju NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (slika 5D).

Ti rezultati kažejo, da je razmnoževanje koronavirusov v tkivni kulturi omejeno (enako ali podobno), kar omejuje naravno mutacijo mest NMPilacije nsp9 v telesu in podpira ključno vlogo tega odziva v življenjskem ciklu koronavirusov.

V zadnjem nizu poskusov smo izdelali C-terminalni His6, označen s SARS-CoV-2 nsp12 in nsp9, ter dve mutirani obliki nsp12 v E. coli.Ostanki aktivnega mesta v domenah NiRAN in RdRp so bili namesto tega uporabite Ala (slika 6A in dodatek SI, tabela S2).K4465 pri SARS-CoV-2 nsp12 ustreza K4135 pri HCoV-229E (dodatek SI, slika S2), za katerega se je izkazalo, da je potreben za aktivnost NiRAN in replikacijo HCoV-229E (sliki 3D in E).Ta ostanek ustreza tudi ostanku arterijskega virusa EAV nsp9 K94, za katerega se je prej izkazalo, da je potreben za NiRAN samoUMPilacijo/samo-GMPilacijo (16).Kot je prikazano na sliki 6B, ima SARS-CoV-2 nsp12 aktivnost UMP transferaze z uporabo nsp9 kot substrata, medtem ko je mutant aktivnega mesta nsp12_K4465A neaktiven.Dvojna substitucija v značilnem zaporedju SDD RdRp motiva C ne vpliva na aktivnost UMP transferaze (slika 6B), kar kaže, da aktivnost RdRp nima neposrednega učinka na nsp9 UMPilacijo.Podobni podatki so bili pridobljeni z uporabo CTP, GTP in ATP (dodatek SI, slika S10).Če povzamemo, ti podatki kažejo, da ima NMPilacija nsp9, ki jo posreduje NiRAN, konzervativno aktivnost pri koronavirusih, ki predstavljajo različne rodove poddružine ortokoronavirusov.

SARS-CoV-2 nsp12 posredovana NMPilacija nsp9.(A) SDS-poliakrilamidni gel, obarvan s Coomassie, ki prikazuje rekombinantni protein, uporabljen v testu NMPilacije.Kot kontrolo je bil uporabljen mutantni protein s substitucijo aktivnega mesta v domeni NiRAN (K4465A) in domeni RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Oštevilčenje ostankov temelji na položaju v pp1ab.(B) Avtoradiograf detekcije UMPilacije z uporabo nsp9-His6 in [α-32P]UTP kot substrata nsp12-His6 (divji tip [wt] in mutant).Molekulska masa (v kilodaltonih) označenega proteina je prikazana na levi.

Domene NiRAN so na splošno ohranjene v Nidovirales (16), kar kaže, da katalizirajo encimske reakcije, ki so bistvene za razmnoževanje Nidovirusa.V tej študiji nam je uspelo dokazati, da domena NiRAN koronavirusa prenaša NMP (generiran iz NTP) na nsp9, skrivnostni protein, ki veže RNK, ki sodeluje pri replikaciji virusa (26 ?? 29), da ga določimo kot naravno tarčo in partner coronavirus RTC.

Domena NiRAN ima tri zaporedne motive (AN, BN in CN), ki vsebujejo zelo majhno število ostankov, ki so ohranjeni v vseh družinah v monofiletičnem, a zelo diferenciranem redu Nidovirales (8, 16).Nedavne študije so pokazale, da so strukturno povezani z večinoma neopredeljeno družino beljakovin, podobnih protein kinazi, ki so se prvotno imenovali družina SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteini, povezani s SelO, imajo kinazne gube, vendar nimajo več ohranjenih ostankov aktivnega mesta v klasičnih kinazah (22, 32).Na podlagi obratne orientacije molekul ATP, vezanih na aktivno mesto in stabiliziranih s posebnimi interakcijami, je bila hipoteza SelO in nato potrjena, da prenaša AMP (namesto fosfata) na proteinski substrat (22), medtem ko ima drugi bakterijski SelO podoben protein YdiU nedavno je bilo dokazano, da katalizira kovalentno vezavo UMP na ostanke Tyr in His različnih proteinskih substratov (33).

Da bi potrdili in razširili napoved domnevnih ostankov aktivnega mesta koronavirusne domene NiRAN, smo uporabili biokemične in reverzne genetske metode za izvedbo analize mutacij na koronavirusu nsp12 (slika 3D ter dodatek E in SI, slika S3 in tabela) S1â S4).Podatki kažejo, da zamenjava HCoV-229E K4135, R4178 in D4280 z Ala odpravi in ​​vitro aktivnost NMP transferaze in replikacijo virusa v celični kulturi (slika 3D ter dodatki E in SI, slika S3), kar potrjuje njihovo prisotnost v NTP γ-fosfatu (K4135, R4178) in koordinacijo kovinskih ionov aktivnega mesta (D4280).Pokazalo se je, da substitucija E4145A ohranjenega Glu v območju virusa ptičjega gnezda, za katerega je bilo predvideno, da stabilizira položaj K4135 (17), odpravi replikacijo virusa, vendar se je presenetljivo aktivnost ohranila v testu NMPilacije in vitro (slika 3D in E in Dodatek SI, slika S3 in tabele S1–S4).Podobno opažanje je bilo narejeno, ko je bila ustrezna zamenjava uvedena v homolog YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Ti podatki skupaj podpirajo regulativno funkcijo tega ohranjenega ostanka in ne katalitične funkcije.

Zamenjava ohranjenega ostanka Phe (F4281A) znotraj območja nestovirusa v domeni HCoV-229E NiRAN (8) je povzročila zmanjšanje aktivnosti NMPilacije in vitro in znatno zmanjšanje replikacije virusa v celični kulturi (slika 3D, E in SI) dodatek, slika S3).Podatki so skladni s pomembno regulativno funkcijo tega ostanka, kot je homologni DFG motiv Phe ostanek, prikazan prej.V klasičnih protein kinazah je del Mg2+ vezavne zanke in pomaga pri sestavljanju in uravnavanju hrbtenice???Potreben za učinkovito katalitično aktivnost (32, 34).Zamenjava Ala in Arg za ostanke K4116 (v motivu preAN) je odpravila replikacijo virusa in, kot je bilo pričakovano, imela različne učinke na aktivnost transferaze NMP in vitro, odvisno od uvedene stranske verige aminokislin (slika 3D in dodatki E in SI , slika S3).Funkcionalni podatki so skladni s strukturnimi informacijami, kar kaže, da je ta ostanek vzpostavil interakcijo z ATP fosfatom (17).V domeni NiRAN drugih družin ugnezdenih virusov položaj HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 zasedajo Lys, Arg ali His (8), kar kaže, da je funkcionalna omejitev tega specifičnega ostanka popustila.Zamenjava D4188A in D4283A odpravi ali močno zmanjša encimsko aktivnost in odpravi razmnoževanje virusa (slika 3).Ta dva ostanka sta ohranjena v večini (vendar ne v vseh) ugnezdenih virusih (8), kar kaže na pomembno družinsko specifično, vendar morda nekatalitično funkcijo.Kot kontrole so bile uporabljene substitucije Ala več drugih ostankov Lys in Asp (K4113A, D4180A, D4197A in D4273A), ki niso ohranjeni v družinah Coronaviridae ali drugih družinah Nestioviridae (8).Kot je bilo pričakovano, so te zamenjave v veliki meri sprejemljive, z rahlim zmanjšanjem aktivnosti encimov in virusne replikacije v nekaterih primerih (slika 3 in dodatek SI, slika S3).Na splošno so podatki o mutagenezi koronavirusa zelo skladni z lastnimi GMP in podatki o obratni genetiki EAV NiRAN-RdRp (16), v katerih EAV nsp9 (ortolog koronavirusa nsp12) ostanek K94 (ustreza HCoV- 229E K4135) pomembno deluje), R124 (ustreza R4178), D132 (ustreza D4188), D165 (ustreza D4280), F166 (ustreza F4281).Poleg tega so podatki o mutagenezi HCoV-229E skladni in razširjeni s predhodno prijavljenimi podatki o reverzni genetiki SARS-CoV (16), prav tako zelo podobni tistim, opaženim za ustrezen motiv CN Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. opisani fenotip -F219A in HCoV-229E_F4281A (slika 3 D in E ter dodatek SI, slika S3 in tabela S1-S4).

V primerjavi z ortologi EAV (16), ki imajo jasno prednost UTP in GTP (v reakciji samoNMPilacije), naša študija kaže, da je lahko domena NiRAN koronavirusa (predstavljena s HCoV-229E in SARS-CoV-2) učinkovito prenesenih vseh štirih NMP, čeprav obstaja majhna prednost za UMP (sliki 1 in 3).Relativno nizka specifičnost specifičnega kosubstrata NTP je skladna z nedavno poročano superkompozitno strukturo SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, v kateri se ADP-Mg2+ veže na aktivno mesto NiRAN, ne pa tudi na adeninski del nastajanja specifičnih interakcij (17).V naši študiji vrsta nukleotida, uporabljenega v reakciji NMPilacije, nima diferencialnega učinka na aktivnost mutantnega proteina (dodatek SI, slika S3), kar kaže, da noben od teh ostankov ni tesno povezan z vezavo specifične nukleobaze.Strukturno osnovo in potencialni biološki pomen različnih preferenc kosubstratov NTP, opaženih v domenah NiRAN koronavirusov in arterijskih virusov, je treba še preučiti;lahko so resnične ali pa so posledica omejitev njihovih študij.Trenutno ni mogoče izključiti, da ima potencialna aktivnost NMPylatorja domene NiRAN arterijskega virusa (v primerjavi s predhodno opisano aktivnostjo samo-NMPylation) drugačno preferenco kosubstrata, ob upoštevanju, da je podobnost med arterijskim in koronavirusnim virusom Domena NiRAN je na meji.Primerjava na podlagi zaporedja (16).V primerjavi s psevdokinazo SelO, ki uporablja Mg2+ kot kofaktor, je aktivnost koronavirusa in arterijskega virusa NiRAN odvisna od Mn2+ (16) (slika 3C in dodatek SI, slika S1).The Mn2+ dependence and obvious preference for UTP is an unusual feature of protein NMPylators, and has only recently been confirmed in the YdiU protein of Salmonella typhimurium, which catalyzes the strict Mn2+-dependent protein chaperone UMPylation to protect cells from stress induction Cell ATP pool ( 33).

Nedavno opisana strukturna podobnost med domeno NiRAN koronavirusa in celičnimi protein kinazami (17, 19) zagotavlja dodatno podporo sposobnosti NiRAN, da kovalentno poveže NMP z drugimi proteini, o katerih smo poročali v tej študiji.Naše iskanje možnih tarč NiRAN smo osredotočili na proteine, ki jih kodira HCoV-229E ORF1a, za katere je znano, da neposredno ali posredno pomagajo RTC-jevi replikazi, kodirani z ORF1b (12, 35).Naši poskusi zagotavljajo prepričljive dokaze za učinkovito in specifično NMPilacijo nsp9 (slika 2).Če se ciljni protein uporabi v molskem presežku, ki je 8- do 10-krat večji od presežka encima (nsp12), se potrdi, da je nsp9 popolnoma (mono)NMP-iziran (slika 4).Ugotovili smo, da je interakcija med nsp12 in nsp9 kratkotrajna in ne bo tvorila stabilnega kompleksa z nsp9 (v odsotnosti drugih podenot RTC).To ugotovitev podpirajo študije interakcij proteinov na proteomu SARS-CoV (35).Analiza MS je identificirala primarni amin N-terminalnega ostanka nsp9 kot mesto NMPilacije (dodatek SI, slika S5).Tvorba fosforamidatne vezi in N-terminalne amino skupine razlikuje aktivnost NMPilacije, ki jo posreduje NiRAN, od reakcije AMPilacije, ki jo posreduje Pseudomonas syringae SelO, ki katalizira tvorbo O-povezanega AMP na ostankih Ser, Thr ali Tyr Peptidni adukt ( 22) in S. typhimurium YdiU tvori O-povezane (s Tyr) in N-povezane (s His) adukte peptid-UMP.Omejene informacije, ki so na voljo o družini proteinov SelO, kažejo, da se člani te velike družine beljakovin močno razlikujejo pri tvorbi aduktov peptid-NMP.To je zanimiva ugotovitev, ki si zasluži nadaljnjo študijo.

Podatki, pridobljeni v tej študiji, so nas pripeljali do hipoteze, da NMPilacija nsp9 zahteva prosti N-konec.V kontekstu replikacije virusa bo to zagotovljeno s proteolitično cepitvijo predelovalnega mesta nsp8|nsp9 v poliproteinu replikaze pp1a, ki ga posredujeta Mpro in pp1ab.Pri večini koronavirusov je razlika med tem posebnim mestom (VKLQ|NNEI pri HCoV-229E) in vsemi drugimi mesti cepitve Mpro koronavirusa v tem, da Asn (namesto drugega majhnega ostanka, kot je Ala, Ser ali Gly) zaseda P1â???Lokacija (36).Podatki o cepitvi peptidov, pridobljeni v zgodnjih študijah, so pokazali, da je bila učinkovitost cepitve mesta nsp8|nsp9 nižja od učinkovitosti drugih mest, kar kaže, da 1) ima lahko to specifično mesto regulativno vlogo pri pravočasni usklajeni obdelavi C-terminala pp1a regija ali 2) a Vloga posebnega ohranjenega N-konca nsp9 pri replikaciji virusa (37).Naši podatki (slika 5A) so pokazali, da je bila rekombinantna oblika nsp9, ki nosi pravo N-terminalno zaporedje, učinkovito NMPizirana z nsp12.N-terminalno bočno zaporedje je bilo odstranjeno s faktorjem Xa (nsp9-His6; SI dodatek, tabela S1) ali Mpro-posredovano cepitev (nsp7-11-His6; slika 5A in SI dodatek, tabela S1).Pomembno je, da je nerazrezani prekurzor nsp7-11-His6, ki vsebuje nsp9, pokazal odpornost na NMPilacijo nsp12, kar je skladno z našimi podatki, kar kaže, da se adukt nsp9-NMP tvori preko N-terminalnega primarnega amina (dodatek SI, slika S5) .Da bi pridobili globlje razumevanje specifičnosti substrata NiRAN, smo se nato osredotočili na sosednje N-terminalne ostanke nsp9.V odsotnosti drugih proteinov so strukturno prilagodljivi, kar preprečuje, da bi jih zaznali v neoznačeni obliki nsp9 (26, 28, 38), kar kaže na njihovo omejeno naravno variacijo. To je posledica pomembnega zaporedja specifičnega (ni povezanega s sekundarno strukturo) funkcijo N-terminalnega fragmenta nsp9.Ala substitucije ohranjenih ostankov v tej regiji (sliki 5C in D ter dodatek SI, slika S8) razkrivajo, da je N3826 bistven za NMPilacijo nsp9 in vitro, medtem ko substitucije N3825A in E3827A povzročijo zmanjšanje NMPilacije, medtem ko substitucije M3829A in P3830A ne .Očitno vpliva na NMPilacijo nsp9.Čeprav ima substitucija N-terminalnega Asn (N3825A, N3825S) le zmeren učinek na nsp9 NMPilacijo in replikacijo virusa v celični kulturi (sliki 5C in D), je brisanje zaporedja ostankov Asn iz N-terminalnega dipeptida 3825-NN proved to be It is lethal to viruses, indicating that one Asn residue is required before another residue at the N-terminus, preferably Asn, although it seems that substitution of similar residues can be partially tolerated (Figure 5B, C, and D).Sklepamo, da dipeptid 3825-NN, zlasti ohranjen in esencialni ostanek N3826 v območju koronavirusa (dodatek SI, slika S6), zagotavlja pravilno vezavo in orientacijo N-konca nsp9 na aktivnem mestu NiRAN.

Zamenjava Ala (E3827A) za ohranjeni Glu vseh poddružin ohrani NMPilacijo nsp9 in vitro, vendar je smrtonosna za viruse v celični kulturi (sliki 5C in D), kar kaže na dodatno funkcijo tega ostanka, na primer pri ključnih interakcijah (NMPiliran ali nespremenjen ) nsp9 N-konec in drugi dejavniki, ki sodelujejo pri replikaciji virusa.Mutacije Nsp9 niso vplivale na proteolitični proces nsp9 ali katerega koli sosednjega nssp (39) (Dodatek SI, slika S9), kar kaže, da letalnih fenotipov več opaženih mutacij nsp9 ni povzročila disregulacija območja pp1a na koncu proteolitičnega procesa C .

Zgornji podatki zagotavljajo dokaze, da je po obdelavi mesta cepitve nsp8|9 v pp1a/pp1ab, ki jo posreduje Mpro, lahko N-konec nsp9 UMPiliran (ali delno spremenjen z drugim NMP).Poleg tega so nas odlična ohranjenost N-konca nsp9 (vključno s posameznimi in invariantnimi ostanki Asn v družini koronavirusov) in povratni genetski podatki, pridobljeni v tej študiji (sliki 3E in 5D), pripeljali do zaključka, da je opisana NMPilacija nsp9 je biološko povezan in bistven za replikacijo koronavirusa.Funkcionalne posledice te modifikacije je treba še preučiti, na primer v zvezi s prej opisano (nespecifično) aktivnostjo vezave RNA nsp9 (nespremenjena oblika) (2628).N-terminalna NMPilacija lahko vpliva tudi na interakcijo nsp9 s substrati beljakovin ali RNA ali na tvorbo različnih štirinivojskih sklopov.Te so opazili v strukturnih študijah in potrdili so, da so funkcionalno povezani z replikacijo koronavirusa, čeprav zlasti v odsotnosti te modifikacije (26-ââ29, 40).

Čeprav je treba ciljno specifičnost domene NiRAN koronavirusa še podrobneje opisati, naši podatki kažejo, da je specifičnost ciljne beljakovine domene NiRAN koronavirusa zelo ozka.Čeprav ohranitev ključnih ostankov aktivnih mest (8, 16) v domeni NiRAN vseh družin nidovirusov močno podpira aktivnost ohranjenih teh proteinov NMPylator, je treba opredeliti identiteto žepnih ostankov za vezavo substrata te domene. Ohranjanje in ohranitev , in se lahko razlikujejo med različnimi družinami namenov Nidovirales.Podobno je treba še določiti ustrezne cilje drugih ugnezdenih virusov.Lahko so oddaljeni ortologi nsp9 ali drugih proteinov, ker so sekvence zunaj petih domen replikaz, ki so na splošno ohranjene v ugnezdenih virusih, manj ohranjene (8), vključno z nizom genoma med Mpro in NiRAN. Med njimi se nsp9 nahaja v corona virus.

Poleg tega trenutno ne moremo izključiti možnosti, da ima domena NiRAN dodatne (vključno s celičnimi) cilje.V tem primeru je vredno omeniti, da imajo bakterijski homologi v tem nastajajočem proteinu NMPylatorji (NMPylatorji) (30, 31) »glavne regulatorje«?NMP modulira različne celične beljakovine za uravnavanje ali odpravo njihovih nadaljnjih aktivnosti, s čimer igra vlogo pri različnih bioloških procesih, kot sta odziv celic na stres in redoks homeostaza (22, 33).

V tej študiji (sliki 2 in 4 ter dodatek SI, sliki S3 in S5) smo lahko dokazali, da je nsp12 prenesel del UMP (NMP) na en sam (ohranjen) položaj v nsp9, medtem ko drugi proteini niso bili spremenjeni v uporabljeno Pod pogoji je podprta dobro definirana (namesto ohlapna) specifičnost substrata.Skladno s tem je v primerjavi z N-terminalno NMPilacijo nsp9 lastna aktivnost NMPilacije nsp12 zelo nizka, njeno odkrivanje zahteva daljši čas izpostavljenosti avtoradiografiji in uporabi se 10-kratno povečanje koncentracije nsp12.Poleg tega naša analiza MS ni uspela zagotoviti dokazov za NMPilacijo nsp12, kar nakazuje, da je samo-NMPilacija domene NiRAN (v najboljšem primeru) sekundarna aktivnost.Vendar je treba opozoriti, da so druge študije zagotovile predhodne dokaze, da lahko status samoAMPilacije bakterijskega NMPylatorja nadzoruje njihovo NMPilacijsko aktivnost na drugih proteinskih substratih (22, 33).Zato je potrebnih več raziskav za raziskovanje možnih funkcionalnih učinkov dejavnosti samo-NMPilacije, o katerih so poročali za EAV nsp9 (16) in koronavirus nsp12 (ta študija), vključno s predlaganim spremljevalnim učinkom na zvijanje C-terminalne domene RdRp ( 16) ).

Prej je bilo obravnavanih več hipotez o možnih spodnjih funkcijah nidoviralne domene NiRAN, vključno z ligazo RNA, gvanilat transferazo, omejeno z RNA, in aktivnostjo priprave beljakovin (16), vendar nobena od njih ni združljiva z razpoložljivimi spodnjimi funkcijami.Podatki, pridobljeni v naslednjih položajih, so popolnoma enaki času brez dodatnih predpostavk.Podatki, pridobljeni v tej študiji, so najbolj skladni s (vendar ne morejo dokazati), da je domena NiRAN vključena v začetek sinteze RNA, ki jo povzroči protein.Prej je veljalo, da je funkcija domene NiRAN v 5??Ti in podpora drugih podatkov ne vplivajo na reakcije omejevanja ²-RNA ali ligacije RNA.Zato se na primer šteje, da aktivno mesto NiRAN vključuje ohranjeni Asp kot splošno bazo (D252 pri Pseudomonas syringae SelO; D4271 pri HCoV-229E pp1ab; D208 pri SARS-CoV-2 nsp12) (SI dodatek, slika 2 ).S2) (17, 22, 33), medtem ko katalizo v ATP-odvisni ligazi RNA in encimu za zapiranje RNA izvaja kovalentni intermediat encima-(lizil-N)-NMP, ki vključuje nespremenjen ostanek Lys ( 41).Poleg tega izjemna specifičnost koronavirusa NiRAN, ki temelji na zaporedju, za ohranjene beljakovinske tarče in sproščena specifičnost za kosubstrate NTP (raje UTP) nasprotuje funkcijam omejevanja, ki jih posreduje NiRAN, ali funkcijam, podobnim ligazi RNA.

Očitno je potrebno veliko dodatnega dela za preverjanje in, če je dokazano, podrobnejšo razlago možne vloge nsp9-UMP (nsp9-NMP) pri proteinsko inducirani sintezi RNK, ki bo povezala več zanimivih, a (doslej) poročil, o katerih so že poročali .Izolirana opažanja.Na primer, ugotovljeno je bilo, da se konec negativne verige RNA koronavirusa začne z oligo(U) verigo (42, 43).Ta ugotovitev je skladna z idejo, da se sinteza negativne verige RNA sproži z vezavo UMPilirane oblike nsp9 na poli(A) rep (sprožilci), ki ga lahko spodbuja njegova vezava na RNA Aktivnost in/ali interakcija z drug protein RTC.The UMP portion provided by nsp9 can then be used as a “primer” for nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, using the 3??²-poly(A) tail in the genomic RNA or Another oligo (A)-containing sequence služi kot predloga, podobno mehanizmu, uvedenemu za protein VPg pikornavirusa (44).Kaj pa, če je predlog »nenormativen«????The initiation of the (protein-induced) negative-strand RNA synthesis provides a link to the observations, indicating that the coronavirus negative-strand RNA has UMP (instead of UTP) at its end (42), which is considered to indicate that the nukleinska kislina Dicer cepi konec, fosforiliran z neznano za uridin specifično endonukleazo.45).Glede na to poročilo je mogoče te prejšnje ugotovitve zdaj ponovno preučiti in razširiti z nadaljnjimi raziskavami.

Če povzamemo, so naši podatki določili specifično aktivnost lastniške ugnezdene virusne encimske oznake, povezane z RdRp na N-koncu.Skozi Mpro-posredovano cepitev na mestu cepitve nsp8 | 9 lahko tarčo nsp9 uporabimo za NMPilacijo, kar kaže na funkcionalno spajanje med proteazo in domeno NiRAN, ki sega do RdRp.Ohranjanje ključnih ostankov v aktivnem mestu nsp12 NiRAN in tarči nsp9 v kombinaciji s podatki, pridobljenimi iz dveh koronavirusov, vključno s SARS-CoV-2, zagotavlja trdne dokaze, da je NMPilacija nsp9 koronavirus. Konzervativne značilnosti so tudi ključni korak pri replikaciji virusa.Razpoložljivi podatki nas pripeljejo do zaključka, da je specifična vloga NMPilirane oblike nsp9 pri sintezi RNA, ki jo povzroči beljakovina, razumen scenarij za koronavirus in druge ugnezdene viruse, NiRAN pa lahko cilja tudi na druge neidentificirane beljakovine.Regulirajte virus.Interakcija gostitelja.Če bo potrjeno, bo vpletenost proteinskih začetnikov v sintezo virusne RNK povečala afiniteto zaporedja domen Mpro/3CLpro in RdRp med predhodno odkritim koronavirusom in pikornavirusom podobnim superskupinom (9), ki sta zdaj združeni v nedavno ustanovljenih Pisonivirites ( 46) v kategoriji.

Naši podatki tudi kažejo, da se lahko osnovne, selektivne in konzervativne encimske aktivnosti, opredeljene v tej študiji, uporabijo kot tarče za protivirusna zdravila.Spojine, ki ovirajo vezavo (in kasnejšo modifikacijo) ohranjenega N-konca nsp9 na aktivnem mestu NiRAN, je mogoče razviti v učinkovita in vsestranska protivirusna zdravila, primerna za zdravljenje živalskih in človeških koronavirusov iz različnih (pod)rodov okužb , vključno s SARS-CoV-2 in koronavirusom bližnjevzhodnega respiratornega sindroma.

Kodirno zaporedje proteina koronavirusa, proizvedenega v tej študiji, je bilo pomnoženo z RT-PCR z uporabo RNA, izolirane iz Huh-7, okuženega s HCoV-229E, ali Vero E6, okuženega s SARS-CoV-2, in vstavljeno s standardnimi postopki kloniranja.ekspresijski vektor pMAL-c2 (Biološki laboratorij Nove Anglije) ali pASK3-Ub-CHis6 (47) (Dodatek SI, tabeli S1 in S2).Substitucije z enim kodonom so bile uvedene z na mesto usmerjeno mutagenezo na osnovi PCR (48).Za proizvodnjo fuzijskega proteina MBP smo celice E. coli TB1 transformirali z ustreznim plazmidnim konstruktom pMAL-c2 (dodatek SI, tabela S1).Fuzijski protein je bil prečiščen z amilozno afinitetno kromatografijo in razcepljen s faktorjem Xa.Kasneje je bil C-terminalni His6-označen protein prečiščen z Ni-imobilizirano kovinsko afinitetno kromatografijo (Ni-IMAC), kot je opisano prej (49).Za proizvodnjo fuzijskega proteina ubikvitina so celice E. coli TB1 uporabile ustrezen plazmidni konstrukt pASK3-Ub-CHis6 (Dodatek SI, tabeli S1 in S2) in plazmidno DNA pCGI, ki kodira za ubikvitin specifično C-terminalno hidrolazo 1 (Ubp1).Preoblikovanje (47).Koronavirusni protein, označen s C-koncem His6, je bil prečiščen, kot je opisano prej (50).

Test samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12-His6 je bil izveden, kot je opisano v EAV nsp9 (16).Na kratko, nsp12-His6 (0,5 µM) vsebuje 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etansulfonske kisline (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitola (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM pufra, inkubirajte navedeni NTP in 0,17 µM se ujema z [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) pri 30 °C 30 minut.V vseh drugih (standardnih) testih NMPilacije NMPilacije nsp9, posredovane z nsp12, so reakcijski pogoji prilagojeni, kot sledi: nsp12-His6 (0,05 µM) in nsp9-His6 (4 µM) v prisotnosti 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM označenega NTP in 0,17 µM ujemajočega se [α32-P]NTP.Po 10 minutah inkubacije pri 30 °C smo reakcijski vzorec zmešali s pufrom vzorca SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glicerola in 0,005 % bromofenola. modra.Protein smo denaturirali s segrevanjem pri 90 °C 5 minut in ločili z 12 % SDS-PAGE.The gel is fixed and stained with Coomassie Brilliant Blue solution (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, and exposed to a phosphorescent imaging screen for 20 hours (to detect nsp12 from NMPylation) ali (največ) 2 uri (za oceno NMPilacije nsp9).Naprava Typhoon 9200 (GE Healthcare) je bila uporabljena za skeniranje zaslona, ​​ImageJ pa je bil uporabljen za analizo jakosti signala.

Za analizo MS sta bila uporabljena 1 µM nsp12-His6 in 10 µM nsp9 (brez oznake heksahistidina) v analizi NMPilacije (dodatek SI, tabela S1) in uporabljena je bila povečana koncentracija 500 µM UTP in GTP.Odvisno od njihove koncentracije in pričakovane kakovosti beljakovin je bil za razsoljevanje 1 do 10 µL pufriranih beljakovinskih raztopin na spletu uporabljen sistem Waters ACQUITY HPLC razreda H, opremljen s kolono MassPrep (Waters).The desalted protein is eluted into the electrospray ion source of Synapt G2Si mass spectrometer (Waters) through the following gradient of buffer A (water/0.05% formic acid) and buffer B (acetonitrile/0.045% formic acid), and the column temperature is 60 °C in hitrost pretoka 0,1 ml/min: izokratsko eluiranje s 5 % A 2 minuti, nato linearni gradient do 95 % B v 8 minutah in vzdrževanje 95 % B še 4 minute.

Zaznavajo se pozitivni ioni z masnim razponom od 500 do 5000 m/z.Glu-fibrinopeptid B se meri vsakih 45 sekund za samodejno korekcijo premika mase.Uporabite programsko opremo instrumenta MassLynx z razširitvijo MaxEnt1 za dekonvolucijo povprečnega spektra po odbitku osnovne črte in glajenju.

UMPiliran HCoV-229E nsp9 smo razgradili z dodajanjem modificiranega tripsina stopnje sekvenciranja (Serva) in inkubirali čez noč pri 37 °C.Za razsoljevanje in koncentriranje peptidov smo uporabili vrtljivo kolono Chromabond C18WP (številka dela 730522; Macherey-Nagel).Končno smo peptid raztopili v 25 µL vode, ki je vsebovala 5% acetonitrila in 0,1% mravljinčne kisline.

Vzorce smo analizirali z MS z uporabo masnega spektrometra Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Vrhunski sistem nanoâ HPLC (Dionex), opremljen s 50 cm??75 μm C18 RP kolona, ​​polna 2,4 μm magnetnih kroglic (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Povežite se z masnim spektrometrom na spletu prek vira nanopršila Proxeon;vbrizgajte 6 µL raztopine za razgradnjo tripsina v notranji premer 300 µm ×??1 cm C18 PepMap kolona za predkoncentracijo (Thermo Scientific).Z uporabo vode/0,05 % mravljinčne kisline kot topila je bil vzorec samodejno ujet in razsoljen pri pretoku 6 µL/min.

Naslednja gradienta voda/0,05 % mravljinčna kislina (topilo A) in 80 % acetonitril/0,045 % mravljinčna kislina (topilo B) sta bila uporabljena za ločevanje triptičnih peptidov pri pretoku 300 nL/min: 4 % B za 5 minut, nato 30 A linearni gradient do 45 % B v minutah in linearno povečanje do 95 % topila B v 5 minutah.Povežite kromatografsko kolono z nanoemiterjem iz nerjavečega jekla (Proxeon) in razpršite eluent neposredno v ogreto kapilaro masnega spektrometra s potencialom 2.300 V. Povezano je pregledno skeniranje z ločljivostjo 60.000 v masnem analizatorju Orbitrap. z vsaj tremi skeniranji podatkov MS/MS, dinamično izključenimi za 30 sekund, z uporabo disociacije, povzročene s trkom z linearno ionsko pastjo, ali disociacije s trkom z višjo energijo v kombinaciji z zaznavanjem orbitalne pasti, ločljivost je 7.500.


Čas objave: 3. avgust 2021